Caspase1活性检测试剂盒

产品描述

• Caspase 1活性检测试剂盒(Caspase 1 Activity Assay Kit)是采用分光光度法检测细胞或组织裂解液中caspase 1酶活性或纯化的caspase 1酶活性的试剂盒。Caspase (Cysteine-requiring Aspartate Protease)是一个在细胞凋亡过程中起重要作用的蛋白酶家族。Caspase 1也称interkeukin1β conberting enzyme (ICE)，有时被写作caspase-1或caspase 1，是caspase家族中唯一可 以剪切IL-1β前体蛋白或IL-18前体产生相应成熟的细胞因子的caspase。Caspase 11可以剪切45kD的caspase 1前体蛋白，产生20kD和10kD的片段，这两个片段可以形成异源二聚体(heterodimer)，并进一步由两个异源二聚体形成四聚体。caspase 1可以通过剪切其凋亡Bcl-XL来调节细胞凋亡，并通过其对一些细胞因子前体的剪切来调控相关免疫反应。
• 本试剂盒是基于caspase 1可以催化底物Ac-YVAD-pNA产生黄色的pNA (p-nitroaniline)，从而可以通过测定吸光度来检测caspase 1的活性。pNA在405nm附近有强吸收。本试剂盒用酶标仪检测或容量不超过100μl的分光光度检测杯检测时，除标准曲线外可以检测20个样品(20T)或者100个样品（100T）。

实验数据

上图是取自同一瓶进入衰亡期的C6细胞，使用我公司和其他进口品牌Caspase1 活性检测试剂盒，加入底物孵育0h, 2h, 4h, 6h，分别记录酶标仪A405nm检测结果。图中蓝色柱子表示blank组，红色柱子是应用美仑公司产品检测结果，绿色柱子代表其它进口品牌检测结果，可以看出，我公司产品检测效果要优于其他进口品牌。

操作步骤

Caspase1 酶活性的检测：

1. 取出适量的Ac-YVAD-pNA (2mM)，置于冰浴上备用。
2. 如下设置反应体系：

   项目	空白对照	样品
   注意：在设置反应体系时先加检测缓冲液，再加待测样品，适当混匀，注意避免在混匀时产生气泡。随后再加入10μlAc-YVAD-pNA (2mM)。
   检测缓冲液	40μl	40μl
   待测样品	0μl	50μl
   裂解液	50μl	0μl
   Ac-YVAD-pNA (2mM)	10μl	10μl
   总体积	100ul	100ul

3. 加入Ac-YVAD-pNA (2mM)后混匀，注意避免在混匀时产生气泡。37ºC孵育60-120分钟。发现颜色变化比较明显时即可测定A405。如果颜色变化不明显，可以适当延长孵育时间，甚至可以孵育过夜。
4. 样品的A405扣除空白对照的A405，即为样品中caspase 1催化产生的pNA产生的吸光度。通过同步骤1中获得的标准曲线对比就可以计算出样品中催化产生了多少量的pNA。
5. 参考Chemicon公司的caspase 1酶活力单位的定义：One unit is the amount of enzyme that will cleave 1.0nmol of thecolorimetric substrate Ac-YVAD-pNA per hour at 37ºC under saturated substrate concentrations。即一个酶活力单位定义为当底物饱和时，在37ºC一个小时内可以剪切1nmol Ac-YVAD-pNA产生1nmol pNA的caspase 1的酶量。这样就可以计算出样品中含有多少个酶活力单位的caspase 1。说明：在本试剂盒的检测体系中，底物的起始浓度为0.2mM，此时底物是饱和的，对于许多样品而言在37ºC孵育2个小时以内底物都是饱和的；对于样品中caspase 1酶活力特别高的情况，须用裂解液适当稀释样品后再进行测定。
6. 用Bradford法检测待测样品中的蛋白浓度(由于裂解液中含有较高浓度的DTT，不适合采用BCA法进行蛋白浓度测定)。这样就可以计算出一个样品单位重量蛋白中所含的caspase 1的酶活力单位。

保存条件

-20℃保存，Ac-YVAD-pNA和pNA需要避光保存。