夫拉平度(Alvocidib)

产品描述

Flavopiridol (Alvocidib)与ATP竞争性抑制CDKs，包括CDK1，CDK2，CDK4和CDK6，IC50约为40 nM。作用于CDK1，2，4，6比作用于CDK7选择性强7.5倍。Flavopiridol最初被发现能抑制EGFR和PKA。Phase 1/2。

靶点

CDK1[1]

CDK2[1]

CDK4[1]

CDK6[1]

CDK7[1]

IC50

40 nM

40 nM

40 nM

40 nM

300 nM

体外研究

作为CDK广谱抑制剂，Flavopiridol可以抑制细胞周期进展，使其停在G1期或G2期。0.3 μM Flavopiridol作用于MCF-7或MDA-MB-468细胞，通过抑制CDK4或CDK2激酶活性，而诱导细胞周期停在G1期。[4]Flavopiridol作用于无关激酶，如MAP, PAK, PKC,和EGFR，活性低很多，IC50 >14 μM。Flavopiridol显著抑制HCT116, A2780, PC3,和Mia PaCa-2细胞集落生长，IC50分别为13 nM, 15 nM, 10 nM,和36 nM。[1]Flavopiridol作用于多种肿瘤细胞系，具有细胞毒性，IC50为作用于LNCAP的16 nM到作用于K562的130 nM。[5]Flavopiridol也有效抑制糖原合成激酶-3(GSK-3)的活性，IC50为280 nm。[2]与其他CDKs相比, Flavopiridol抑制CDK7活性时效果稍弱，IC50为875 nM。Flavopiridol (0.5 μM)抑制pSer807/811 Rb和pThr199 NPM,而在pThr821 Rb上观察到轻微变化。Flavopiridol也降低全部RNA聚合酶II水平,及RNA聚合酶II在CTD重复序列在Ser2 Ser5位点磷酸化。[3]

体内研究

Flavopiridol按7.5 mg/kg剂量处理P388小鼠白血病，持续7天，具有轻微抗癌活性，导致%T/C值为110,且有效作用于皮下抑制人A2780卵巢癌的裸鼠，细胞对数杀灭(LCK)为1.5。[5]Flavopiridol按1-2.5 mg/kg剂量处理小鼠，持续10天，通过抑制滑膜增生和关节损伤，而显著抑制胶原性关节炎，这种作用存在剂量依赖性，然而抗II型胶原(CII)抗体的血清浓度，和II型胶原对应的增殖维持不变。[6]

特征

Flavopiridol是第一个应用于人临床实验的细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂。

CDK激酶实验

CDK1/cyclin B1激酶实验中,激酶反应包含100 ng表达GST-CDK1/cyclin B1(人)复合体的杆状病毒, 1 μg组蛋白HI, 0.2 μCi [γ-33P]ATP, 25 μM ATP溶于50 μL激酶buffer (50 mM Tris, pH 8.0, 10 mM MgCl2, 1 mM EGTA, 0.5 mM DTT)。CDK2/cyclin E激酶实验中,激酶反应包含5 ng表达GST-CDK2/cyclin E (人)复合体的杆状病毒, 0.5 μg GST-RB融合蛋白(成视网膜细胞瘤蛋白776-928氨基酸), 0.2 μCi [γ-33P]ATP, 25 μM ATP溶于50 μL激酶buffer (50 mM Hepes, pH 8.0, 10 mM MgCl2, 1 mM EGTA, 2 mM DTT)。CDK4/cyclin D1激酶实验中,激酶反应含150 ng表达GST-CDK4/cyclin D1 (人)的杆状病毒, 280 ng Stag-cyclin D1, 0.5 μg GST-RB融合蛋白(成视网膜细胞瘤蛋白776-928氨基酸), 0.2 μCi [γ-33P]ATP, 25 μM ATP溶于50 μL激酶buffer (50 mM Hepes, pH 8.0, 10 mM MgCl2, 1 mM EGTA, 2 mM DTT)。30oC下，CDK1和CDK2反应温育45分钟，CDK4反应温育1小时，加入终浓度为15%的冰冻三氯乙酸(TCA)终止反应。使用Filtermate通用收集器，收集TCA沉淀物转移到GF/C非过滤板上，使用TopCount 96孔液体闪烁计数器测量过滤数。Flavopiridol溶于10 mM二甲基甲酰胺(DMF)中，测定六种浓度，每种重复测三次。实验中DMF终浓度为2%。通过回归曲线分析获得IC50值，变异系数为16%。测定Flavopiridol作用于CDK6的活性,进行过滤-结合实验。反应混合物按如下结合：2 μL CDK6 (0.7 mg/μL), 5 μL组蛋白H1 (6 mg/mL), 14 μL激酶buffer (60 mM β-甘油磷酸, 30 mM p-磷酸硝基苯酯, 25 mM MOPS (pH 7.0), 5 mM EGTA, 15 mM MgCl2, 1 mM DTT, 0.1 mM钒酸钠),在50% DMSO中稀释的3 μL浓度不断增长的Flavopiridol，及6 μL33P-ATP (1 mCi/mL)，非放射性ATP，浓度为90 μM，(终浓度为15 μM)。加入33P-ATP开始反应。反应在30oC下温育20分钟。25 μL等分的上清液点样到Whatman P81磷酸纤维素膜上。使用1%磷酸溶液冲洗过滤器5次。在1 mL闪烁液存在时测定湿过滤器。使用50 nM重组Cdk9/cyclin T在50 mM HEPES pH 7.5, 10 mM MgCl2, 1 mM DTT, 3 μM Na3VO4, 150 μM RNA聚合酶CDT肽和80 μM ATP中测定Cdk9活性。在相同buffer中使用37 nM纯化激酶，在200 μM ATP存在时，10 μM髓鞘蛋白（MBP）作为底物，进行Cdk7检测实验。使用强阴离子交换剂-为基础的检测实验或闪烁接近实验测定Flavopiridol作用于CDK9和CDK7的效果。通过剂量反应曲线计算IC50值。

细胞系

MCF-7, LNCAP, PC3, HCT116, CACO-2, A549, HL60, K562,等等

浓度

溶于DMSO,终浓度为~10 μM

处理时间

72小时

方法

使用不同浓度Flavopiridol处理细胞72小时，加入四唑染料，MTS和吩嗪硫酸甲酯。3小时后,在492 nm处测定吸光值,与存活细胞数成比例。结果表示为IC50值。为了分析细胞周期，细胞在仲甲醛和乙醇中混合，冲洗，然后再悬浮在TdT酶和FITC-dUTP染色液中,再冲洗，使用PI染色，随后进行RNA酶处理，最后使用流式细胞仪分析。

动物模型

腹腔注射P388腹水白血病细胞的雌性Balb/c×DBA/2J F1小鼠,皮下移植A2780, Br-cycE,或A431细胞的Balb/c nu/nu裸鼠

配制

溶于Cremophor/乙醇(50:50)，然后在水中稀释

剂量

~7.5 mg/kg/day

给药处理

腹腔注射