EdU-555细胞增殖检测试剂盒(适用于FACS、FM)

产品描述

美仑EdU-555细胞增殖检测试剂盒(Meilun EdU Cell Proliferation Kit with Alexa Fluor 555)，是一种利用核苷渗入法对细胞增殖情况进行快速、简单、高灵敏检测的试剂盒。其原理为：试剂盒中的EdU(5-ethynyl-2′ -deoxyuridine)是一种胸苷(T)类似物，EdU可以在在细胞周期的S期中替代胸苷掺入到新合成的DNA中；另一方面，EdU上的乙炔基能与叠氮化物(如荧光探针Alexa Fluor 555Azide)通过Cu+的催化发生共价反应，形成稳定的三唑环，该反应非常迅速，被称作点击反应(Click reaction)(图1)。通过点击反应，新合成的DNA会被红色荧光标记，然后通过检测荧光信号实现细胞增殖的检测。

细胞增殖检测是评估细胞活性、遗传毒性及抗肿瘤药物效果等的基础实验手段。细胞增殖检测的方法按照原理通常可以分为五类：膜损伤检测、代谢活性检测、ATP水平测定、DNA合成检测和细胞荧光标记检测法。目前公认的最精确的检测细胞增殖的方法是直接检测细胞中DNA的合成，即核苷渗入法。以前常用的核苷渗入法是BrdU(胸腺嘧啶核苷酸类似物)法，但BrdU法的缺点是需要变性DNA后才能与抗体结合，导致了DNA双链结构的破坏，影响了其他染料的结合染色，导致染色弥散，准确性降低等问题。EdU法作为新型的核苷渗入法具有以下优点：

• 安全—–不使用[3H]thymidine，无放射性污染。
• 简单—–基于小分子化学反应的检测方法，简单高效，仅需三步：EdU孵育；细胞固定；荧光检测。无需DNA变性和孵育抗体。
• 快速—–无需过夜，省却抗原抗体反应。整个检测过程只需 2.5 小时，大大缩短实验周期。
• 准确—–标记率高且无需DNA变性(酸解、热解、酶解等)，可有效避免变性带来的样品损伤，确保细胞核边缘清晰完。
• 灵敏—–无需抗体，检测染料仅为BrdU抗体的1/500，更容易扩散，即使单个增殖细胞也能准确检测。
• 兼容—–对样品几乎无损伤，允许与多种抗体或荧光蛋白同时标记，能够同时检测细胞其他性状特征。

本试剂盒适用于培养的细胞或组织样品，也适用于组织切片，可以检测到细胞或组织样本中的单个增殖细胞，也可以对细胞或组织样本总体的细胞增殖情况进行定量分析。本试剂盒包含EdU法检测所需要的所有组份，同时提供了蓝色细胞核染料Hoechst33342，可以用来复染所有细胞核，也可用于细胞周期分析。

使用本试剂盒所做结果可以用荧光显微镜、激光共聚焦显微镜、流式细胞仪或荧光酶标仪进行检测，也可以用于高内涵筛选(High-Content Screening, HCS)。

针对6孔板培养的细胞（每孔500μl的Click反应液），本试剂盒可以提供50个孔反应的量；针对96孔板培养的细胞（每孔50μl的Click反应液），本试剂盒可以提供500个孔反应的量（不同容器细胞Click反应液的具体用量可参考表1）；针对每管细胞数量为10-100万的流式细胞仪检测（每管500μl的Click反应液），本试剂盒可以提供50管反应的量；针对冰冻或石蜡切片的检测（每个样品100-200μl的Click反应液），本试剂盒可以提供125-250个样品反应的量。

光谱特性：555-Azide：红色荧光，Ex/Em=555/567nm；Hoechst 33342：蓝色荧光，Ex/Em=346/460nm, bound to DNA。

实验应用实例：（由美仑细胞生物学项目组独立完成）

1.悬浮细胞流式检测：

Jurkat细胞只用EdU标记(左列)，或在标记EdU前30min用10mM的DNA合成抑制剂羟基脲(Hydroxyurea)处理(右列)，2小时后染色，然后通过流式细胞仪进行检测。从流式结果图中可以看出，仅EdU标记的细胞有较高比例的红色荧光阳性细胞，呈现红色荧光阴性(弱染色)和阳性(强染色)的两个峰，分别对应于未增殖细胞和增殖细胞。经过Hydroxyurea处理的细胞，红色荧光阳性的细胞几乎完全消失，仅剩下一个红色荧光阴性的峰。

2.贴壁细胞荧光显微镜检测：

CHO-K1细胞只用EdU标记(左列)，或在标记EdU前30min用10mM的DNA合成抑制剂羟基脲(Hydroxyurea)处理(右列)，2小时后染色（步骤最后染Hoechst，方便观察增殖细胞比例），然后通过荧光显微镜进行检测。镜下可见，仅EdU标记的细胞有一部分染上红色荧光的增殖细胞，未增殖细胞的细胞核呈蓝色单染，增殖细胞的细胞核呈红色和蓝色双染；经过Hydroxyurea处理的细胞，几乎没有呈红色荧光的增殖细胞，绝大多数细胞核仅呈蓝色。

保存条件：

-20℃保存，一年有效。555-Azide和Hoechst 33342(1000X)须避光保存。

注意事项：

• 羟基脲(Hydroxyurea)（美仑货号：MB1307）为DNA合成抑制剂，经过10mM羟基脲提前30min处理的细胞，红色荧光阳性的细胞几乎完全消失，因此常被用作EdU实验的阴性对照。
• 配制好的Click-iT Additive Solution请根据每次用量适当分装后-20℃保存，避免反复冻融。Click-iT Additive Solution融化后有白色物质析出为正常现象，请上下颠倒几次，待全部溶解 后使用。溶液一旦呈现棕色，则说明有效成分降解，不能再使用。
• 皂苷促渗液可以用于全血及含红细胞的细胞悬液，以及其他含多种细胞类型的混合细胞悬液的通透。这种促渗液可以在裂解红细胞的同时，维持白细胞的光散射特性。
• 本试剂盒做动物实验时可能需要更多的EdU（美仑货号：MB3074），请根据实验需求用合适稀释液稀释后使用。
• 由于本产品涉及到铜离子催化进行点击反应，请注意以下的兼容性问题及解决方案。本产品完全兼容有机类染料如Alexa Fluor®系列普通染料及fluorescein (FITC)、Allophycocyanin (APC)及APCE-tandems染料；对于Qdot®纳米晶体探针、Horseradish peroxidase (HRP)、R-phycoerythrin (R-PE)和R-PE-tandems染料如Alexa Fluor® 680-R-PE等，需要在点击反应完成后进行反应和 检测；本产品会影响GFP、RFP、mCherry等荧光蛋白的荧光，对于荧光类蛋白如GFP、TC-FlAsH™和TC-ReAsH™类试剂，需要在点击反应前进行反应和检测。Phalloidin (鬼笔环肽)不兼容点击反应，在检测细胞微管时请选用其它探针。
• 如需在传统流式仪上进行总DNA含量的检测，可采取低流速检测。DNA含量检测所用荧光检测信号应与DNA含量成线性关系。EdU标记信号呈现对数放大可以很好的被检测到。
• 为了您的安全和健康，操作时请穿着实验服并佩戴一次性手套。

操作指南

操作方法：请参考说明书