人骨髓间充质干细胞分离液

人骨髓间充质干细胞分离液
本品用于分离人骨髓间充质干细胞
【产品规格】
200ml/Kit
【产品组成】
为方便广大用户使用，试剂内容如下：

【检验方法】 全过程样本、试剂及实验环境均需在20±2℃的条件下进行。
1. 首先制备骨髓单细胞悬液，制备方法详见“骨髓冲洗单细胞悬液制备技术”。
2. 取一支15ml离心管，加入与骨髓单细胞悬液等量的分离液（注：分离液最少不得少于 3ml）。
3. 用吸管小心吸取骨髓单细胞悬液加于分离液液面上，400-550g，离心20-30min。（注： 根据骨髓单细胞悬液量确定离心条件，骨髓单细胞悬液量越大，离心力越大，离心时间 越长，具体离心条件需客户自行摸索，以达到最佳分离效果）。
4. 离心后，此时离心管中由上至下分为四层。第一层为稀释液层。第二层为环状乳白色目的细胞层。第三层为透明分离液层。第四层为红细胞层。
5. 用吸管小心吸取第二层环状乳白色目的细胞层到另一15ml离心管中，向离心管中加入 10ml清洗液，混匀细胞。
6. 250g，离心10min。
7. 弃上清。
8. 用吸管以5ml清洗液重悬所得细胞。
9. 250g，离心10min。
10. 重复7、8、9，弃上清后以0.5ml后续实验所需相应液体重悬细胞。
11. 差异贴壁法纯化细胞

(1) 用干细胞无血清培养基或干细胞完全培养基以1.5-3×10⁶个/ml的密度重悬细胞，将细胞铺于一次性细胞板或细胞瓶中，放于37℃二氧化碳培养箱中进行贴壁培养。

(2)2-4小时内贴壁的为巨噬细胞前体（俗称为单核细胞）。

(3)10-24小时内贴壁的单个核细胞为内皮、内皮祖细胞、干细胞。

(4)不贴壁的为淋巴细胞。

注：
a) 无血清培养基中不含任何动物成分，为得到更佳培养效果可添加10%自体血浆或2-8%的胎牛血清。
b) 完全培养基中含2-20%胎牛血清（血清具体含量由所培养的目的细胞而定）。
c) 由于每种细胞的贴壁时间存在差异可将所得细胞分开已达简单的纯化目的，此法成本相对较低。如需获得高纯度目的细胞则需在使用分离液后选用免疫磁珠阳性或阴性分选。

【骨髓冲洗单细胞悬液制备技术】：

1. 以适当方式处死动物，剥离出股骨或胫骨，用剪刀剪断骨头两端，露出内腔。
2.用注射器吸取适量（根据动物大小）的匀浆冲洗液冲洗出内腔中的骨髓。
3.收集悬液到合适离心管中，反复吹打成单细胞悬液，以70µm细胞筛网过滤。
4.450g，离心10min，弃上清。
5.用样本稀释液重悬细胞浓度为2×10⁸–1×10⁹/ml的单细胞悬液备用（以小鼠为例，一般使用1ml样本稀释液重悬骨髓细胞）。

注：此单细胞悬液制备技术为所有物种通用，做人骨髓如直接抽离出来混悬液，那么可直接从3步开始做，如果抽离混悬液比较粘稠，则需要用匀浆冲洗液悬起来一次在继续制备单细胞悬液

【注意事项】
1. 全过程样本、试剂及实验环境均需在20±2℃的条件下进行。为获得最佳的实验结果，最

好在取样2h内进行实验，样品存放时间越长，细胞分离效果越差。样品放置超过6h后 分离效果更差甚至不能达到分离目的。
2. 本实验最好不要使用高聚合材质（如聚苯乙烯）的塑料制品，应使用无静电、低静电离心管及未经碱处理过后的玻璃制品，因为静电作用将导致细胞贴壁、碱处理的玻璃表面 会变成毛面，影响细胞分离效果。

3. 吸取过多的目的细胞层及分离液层会导致分离液交界处的粒细胞被吸出从而使混杂的粒
细胞数量增加。
4. 分离液用量大于骨髓单细胞悬液样本量时，分离效果更佳。
【储存条件及有效期】 18-25℃保存，有效期2年。本品易感染细菌，需无菌条件操作。无菌条件下操作，启 封后置常温保存。如4℃保存，本分离液易出现白色结晶，影响分离效果。

注：在对离心条件进行调整时，离心转速的加减以50-100g为基数，直至达到最佳分离效果，离心力最小不得小于400g，最大不得大于1200g。离心时间以20-30min为准。