LDN-57444

LDN-57444是一种可逆的竞争性的蛋白酶体抑制剂，抑制Uch-L1时，IC50为0.88 μM，比作用于亚型Uch-L3选择性高30倍。

靶点

体外研究

50 μM LDN-57444处理24小时，抑制70% 蛋白酶活性。25 μM 以上的LDN-57444显著降低细胞存活率，这种作用存在浓度依赖性，50 μM 时，细胞存活率降低至61.81％。LDN-57444通过细胞凋亡途径能够导致细胞死亡，通过降低泛素蛋白酶体系统的活性，并增加高度泛素化蛋白的水平，这两者都可以激活未折叠的蛋白反应。通过激活内质网应激（ERS）可以触发LDN-57444诱导的细胞凋亡。

体内研究

LDN-57444使体内 突触蛋白分布和脊柱形态发生显著改变。LDN处理，导致UCH-L1活性迅速下降，但处理几个小时，对cAMP水平的蛋白酶抑制有没有效果。

b-AP15

1 mg

5 mg

10 mg

1 mM

2.5148 mL

12.5742 mL

25.1484 mL

5 mM

0.5030 mL

2.5148 mL

5.0297 mL

10 mM

0.2515 mL

1.2574 mL

2.5148 mL

50 mM

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HTS 筛选:
开始实验时，0.5 μL 5 mg/mL 实验化合物(约 50 μM 终反应浓度) 或DMSO对照分装到各孔中。酶和底物都在UCH 反应Buffer(50 mM Tris-HCl [pH 7.6], 0.5 mM EDTA, 5 mM DTT, 和0.5 mg/mL卵清蛋白)中制备。每孔加入25 μL 0.6 nM UCH-L1，除了底物对照孔，随后置于自动摇床上震荡45-60秒。酶/化合物的混合物在室温下温育30分钟，然后加入25 μL 200 nM Ub-AMC，开始酶反应。 反应混合物 (300 pM UCH-L1, 100 nM Ubiquitin-AMC 与2.5 μg 实验化合物) 在室温下再温育30分钟，然后每孔加入10 μL 500 mM 乙酸，使反应淬火。使用Coumarin过滤装置（ex=365 nm, em=450 nm），在LJL分析仪上测量荧光发射强度，减去内在化合物的荧光，显示酶活性。DMSO对照组(0.5 μL DMSO, 25 μL UCH-L1, 25 μL 泛素-AMC, 10 μL 乙酸), 酶对照组 (25 μL UCH-L1, 25 μL buffer, 10 μL 乙酸), 底物对照组 (25 μL buffer, 25 μL 泛素-AMC, 10 μL 乙酸), 及抑制剂对照组 (0.5 μL 泛素乙醛[100 nM 储存液], 25 μL UCH-L1, 25 μL泛素-AMC, 10 μL 乙酸) 也在每个实验板中进行，确保实验质量和重复性。如果与对照组相比，该化合物表现出大于60％的抑制率，则被选为潜在的UCH-L1抑制剂。使用相同实验方法，手动进行重复两次UCH-L1酶促反应，确保实验结果。

细胞实验：

• Cell lines:H1299
• Concentrations:~5 μM
• Incubation Time:24 小时
• Method:MTT 实验