DBeQ

DBeQ是选择性的，有效的，可逆的，ATP竞争性的p97抑制剂，IC50为1.5 μM。

靶点

p97

IC50

1.5 μM

体外研究

DBeQ作用于HeLa细胞，抑制UbG76V-GFP, ODD-Luc和Luc-ODC降解，IC50分别为2.6 μM, 56 μM和45 μM。DBeQ作用于N-ethylmaleimide-敏感因子（NSF）和26S蛋白酶，效果至少低50倍。DBeQ与ATP竞争性抑制P97，Ki为3.2 μM，说明DBeQ结合到D2域的活性位点。DBeQ (10 μM)作用于HEK293细胞，有效抑制TCRα-GFP降解。DBeQ作用于HEK293细胞，3小时内诱导CHOP，但不增加p21水平，这种作用存在浓度依赖性。DBeQ (15 μM)作用于Hela细胞，诱导LC3-II在在细胞核及浓缩膜和胞质级组分中大量积累。DBeQ作用于HeLa细胞，通过抑制LC3-II自噬降解，而不是诱导自噬，而发挥作用。DBeQ (10 μM)作用于HeLa细胞，快速促进caspases-3和-7激活。比激活外在caspase-8通路，DBeQ更有效激活内在caspase-9凋亡途径，而STS激活两种途径程度相似。DBeQ作用于多发性骨髓瘤细胞（RPMI8226）比作用于正常人胚肺成纤维细胞（MRC5）效果强5倍，HeLa细胞和Hek293细胞具有中等的敏感性。在ERAD和自噬途径内，DBeQ干扰底物降解。DBeQ (12 μM)作用于HeLa细胞中。抑制细胞中和，这种作用存在剂量依赖性。DBeQ(10 μM)完全抑制病毒和抗体的降解，但不抑制IgG Fc的降解。DBeQ作用于U20S细胞，降低基本的和营养刺激的MTOR靶点磷酸化，与Rapamycin效果类似。

特征

DBeQ快速有效地诱导caspase激活和细胞死亡。

NMS-873

MB3831

MNS (3,4-Methylenedioxy-β-nitrostyrene, MDBN)

1 mg

5 mg

10 mg

1 mM

2.9375 mL

14.6877 mL

29.3755 mL

5 mM

0.5875 mL

2.9375 mL

5.8751 mL

10 mM

0.2938 mL

1.4688 mL

2.9375 mL

50 mM

0.0588 mL

0.2938 mL

0.5875 mL

手动ATP酶实验:
实验 Buffer [20 μL 2.5×浓度, 1×= 50 mM Tris (pH 7.4), 20 mM MgCl2, 1 mM EDTA, 和 0.5 mM tris(2-carboxyethyl)phosphine (TCEP)] 加到96孔板中。纯化的p97(25 μL 50 μM) 975 μL 1× 实验 Buffer中稀释，然后每孔中加入10 μL。每孔加入DBeQ (10 μL) 或 5% DMSO (10 μL) ，实验板在室温下温育10分钟。按如下进行ATP酶实验：每孔加入10 μL 500 μM ATP (pH 7.5), 在室温下温育60分钟, 然后加入50 μL Kinase Glo Plus 试剂,随后在室温下黑暗环境中温育10分钟。使用 Analyst AD读取发光值。在一个浓度范围(0, 0.048, 0.24, 1.2, 6, 和30 μM)按一式三份测定DBeQ。

细胞实验：

• Cell lines:MRC-5, Hek293, HeLa 和 RPMI8226 细胞
• Concentrations:33 μM
• Incubation Time:48 小时
• Method:细胞按每孔5,000个接种于384孔白色固体板中。使用荧光素酶siRNA或p97siRNA（10 nM）进行细胞转染48小时，或在指定时间使用DBeQ处理。每孔加入Caspase-3/7 Glo, caspase-6 Glo, caspase-8 Glo, 或 caspase-9 ，按500rpm震荡混合 1分钟。在室温下温育1小时后，测定发光信号。使用CellTiter-Glo试剂测定细胞存活力。为了测定细胞活力的IC50，使用七种浓度的MG132或DBeQ（开始于μM的三倍连续稀释液）处理细胞48小时。拟合发光信号归一化DMSO处理细胞的百分比，计算IC50值。