KW-2449

KW-2449是一种多靶点抑制剂，最有效作用于Flt3，IC50为6.6 nM，作用于Flt3， Bcr-Abl和Aurora A适度有效；对PDGFRβ， IGF-1R， EGFR没有抑制效果。Phase 1。

特性

Investigated as a FLT3 inhibitor in clinical trials, with others in early development.

靶点

体外研究

KW-2449是FLT3, ABL, ABL-T315I, 和Aurora激酶的多激酶抑制剂，用于治疗白血病患者。KW-2449作用于携带FLT3突变的白血病细胞，通过抑制FLT3激酶，而有效抑制生长，导致磷酸化的-FLT3/STAT5下调,细胞周期停在 G1期，和细胞凋亡。KW-2449口服处理 FLT3突变的移植瘤模型，显著抑制肿瘤生长，具有最低的骨髓抑制率。KW-2449作用于FLT3野生型人白血病，诱导磷酸化的组蛋白 H3降低, 细胞周期停在G2/M,和细胞凋亡。KW-2449作用于抗Imatinib的白血病，通过同时下调BCR/ABL 和Aurora 激酶而释放阻力。人血浆蛋白，如α1-酸性糖蛋白，不会影响KW-2449的抑制活性。KW-2449作用于多种 类型白血病，有效抑制生长。KW-2449作用于携带 FLT3突变和抗Imatinib突变的白血病患者，具有显著活性，且临床研究也获得授权。KW-2449 降低FLT3和 STAT5的磷酸化程度，这种作用存在剂量依赖性。此外, KW-2449有效抑制ABL-T315I, IC50 为 4 nM。另一方面, KW-2449即使浓度为1 μM时，对 PDGFRβ, IGF-1R, EGFR, 及多种丝/苏氨酸激酶没有作用效果。KW-2449 作用于表达FLT3/ITD的白血病细胞和FLT3/KDM激活的以及过表达野生型FLT3的白血病细胞，都有效抑制生长。与抑制生长相一致, KW-2449作用于MOLM-13细胞，抑制FLT3 (P-FLT3) 及其下游分子磷酸-STAT5(P-STAT5)磷酸化，这种作用存在剂量依赖性。而且, KW-2449提高G1期百分数，而降低S期百分数导致凋亡细胞数增高。 KW-2449 可以使组成型活化的WT-FLT3 激酶去磷酸化，而不抑制白血病细胞增殖。KW-2449迅速被吸收，并转化为一个主要的代谢产物M1。临床前期研究显示单胺氧化酶-B(MAO-B)和醛氧化酶使KW-2449转化为其主要代谢产物M1。KW-2449通过抑制FLT3/ITD而调节细胞毒性。KW-2449是FLT3抑制剂，诱导下游靶点STAT5受抑制。KW2449与HDACIs协同作用于Ph+CML细胞，诱导凋亡，这种作用存在时间和浓度依赖性。KW2449作用于CML细胞，协同增强Vorinostat/SNDX275 杀伤力。KW-2449对另外的抗IM Bcr/Abl+的白血病细胞具有活性。KW2449作用于nocodozole处理的K562细胞，适度降低组蛋白 H3 磷酸化, 组蛋白是Aurora B活性指示剂。

体内研究

KW-2449口服处理给药MOLM-13移植瘤模型，处理14天，具有显著的抗癌效果，这种作用存在剂量依赖性。

Tandutinib;MLN518

MB3913

TCS359

MB4352

UNC2025

1 mg

5 mg

10 mg

1 mM

3.0084 mL

15.0421 mL

30.0842 mL

5 mM

0.6017 mL

3.0084 mL

6.0168 mL

10 mM

0.3008 mL

1.5042 mL

3.0084 mL

50 mM

0.0602 mL

0.3008 mL

0.6017 mL

FLT3 磷酸化实验:
在PBS中冲洗白血病细胞，然后通过使细胞再悬浮在裂解液 (20 mM Tris pH 7.4, 100 mM NaCl, 1% Igepal, 1 mM EDTA, 2 mM NaVO4, 及完整 蛋白酶抑制剂KW-2449)中溶解30分钟。抽提物在1.6×104 g转速下离心，得到澄清，检测上清液测定蛋白。移除 50-μg 等分样，作为全细胞裂解液，用于分析 STAT5,剩下的用于与抗FLT3抗体进行免疫沉淀反应。加入抗FLT3抗体 用于抽提，温育过夜，再加入蛋白A琼脂糖，再处理 2小时。测定全细胞裂解液的SDS-PAGE凝胶和免疫沉淀同时进行。转移到Immobilon膜上，使用抗磷酸抗体(4G10) 进行免疫印迹，用于测定磷酸化的FLT3；使用大鼠单克隆抗体作用于磷酸化的STAT5 (Y694残基) 测定全部细胞裂解物凝胶，然后剥离，使用抗FLT3抗体作为二次探针，用于测量全部 FLT3。通过化学发光观察蛋白，使用Kodak BioMax XAR 胶片曝光，显影，然后使用Bio-Rad GS800光密度计扫描。通过剂量反应曲线的线性回归分析，测定抑制50% FLT3 或STAT5磷酸化所需的KW-2449浓度(IC50)。为了分析FLT3和STAT5,收集肝素化管中的外周血，在冰上迅速冷却。样本按900g转速在4oC下离心10分钟。移除血浆，冰冻在−80oC下储存。白细胞层小心转移到冰冻PBS中, 分层到冰冻的Ficoll-Hypaque上, 然后按600g转速在 4oC下离心5分钟。随后所有步骤在 4oC下进行。收集单层细胞，在红血细胞裂解液(0.155 M NH4Cl, 0.01 M KHCO3, 0.1 mM EDTA),中快速清洗，然后再在PBS中洗一遍。然后溶解细胞，用于分析FLT3和 STAT5 。

细胞实验

• Cell lines:MOLM-13和 RS4;11细胞
• Concentrations:33nM, 75nM, 0.1μM, 0.3μM ,0.15μM
• Incubation Time:24, 48, 和72小时
• Method:与KW-2449在37oC下温育72小时后,通过3′-[1-(羰基苯胺)-3, 4-四氮唑]- 双(4-甲氧基-6-硝基) 苯磺酸钠水合物法测定细胞活力使用细胞增殖试剂盒 II测定存活细胞数。为了分析细胞周期,使用 KW-2449处理 MOLM-13 和 RS4; 11细胞。在37oC下温育24,48，和72小时后，分析 DNA含量。使用KW-2449或Imatinib处理24小时后，分析K562, TCC-Y, 和 TCC/Ysr细胞周期分布。
  (Only for Reference)

动物实验

• Animal Models:CBySmn.CB17-Prkdsscid/J (BALB/C) 小鼠, 溶于100 μL PBS的2×106BV173/E255K/Luc cl4 细胞注射到鼠尾部静脉
• Formulation:溶于0.5%甲基纤维素400溶液
• Dosages:32 mg/kg/day, 5 days/week
• Administration:口服处理