Golvatinib (E7050)

Golvatinib(E7050)是双重c-Met和VEGFR-2抑制剂，IC50分别为14 nM和16 nM,不抑制bFGF刺激的HUVEC生长(浓度高达1000 nM)。

靶点

c-Met

VEGFR-2

IC50

14 nM

16 nM

体外研究

体外研究表明E7050可以强有效的抑制c-Met和VEGFR-2的磷酸化。E7050也可以强有效的抑制c-met放大的肿瘤细胞以及HGF或VEGF刺激的内皮细胞生长。在体外E7050通过阻断Met/Gab1/PI3K/Akt通路来避免作用于EGFR突变的肺癌细胞系中所有外源和内源HGF诱导的可逆的，不可逆的以及突变选择性的EGFR-TKIs。E7050还可以防止HCC827细胞因为HGF连续作用而产生的gefitinib抗药性

体内研究

体内实验证实E7050可以抑制肿瘤中c-Met和VEGFR-2的磷酸化，在异种移植模型中强烈抑制肿瘤生长和肿瘤血管发生。高剂量E7050 (50–200 mg/kg)治疗含有c-met扩增的肿瘤细胞系诱导肿瘤恢复和消失。在腹膜模型中E7050具有抗腹膜肿瘤活性并可以延长治疗小鼠的寿命。在另一项异种移植模型研究中Ma-1/HGF引起的肿瘤比对照肿瘤血管生成更多并具有对gefitinib的抗药性。E7050单用可以抑制Ma-1/HGF肿瘤的血管生成和肿瘤生长。E7050与gefitinib联用明显诱导肿瘤退化。

1 mg

5 mg

10 mg

1 mM

1.5781 mL

7.8903 mL

15.7806 mL

5 mM

0.3156 mL

1.5781 mL

3.1561 mL

10 mM

0.1578 mL

0.7890 mL

1.5781 mL

50 mM

–

–

–

免疫印迹分析:
免疫印迹法分析c-Met和VEGFR-2的磷酸化。对于c-Met, 将MKN45 与连续稀释的E7050 在完全培养基中37 °C孵育2 小时。 对于VEGFR-2, HUVEC细胞在不含血清培养基中饥饿培养24 小时。然后 HUVEC与连续稀释的E7050孵育 1 小时，然后与20 ng/mL 人VEGF孵育5分钟。用细胞裂解液(50 mM HEPES [pH 7.4], 150 mM NaCl, 10% 甘油, 1% Triton X-100, 1.5 mM MgCl2, 1 mM EDTA [pH 8.0], 100 mM NaF, 1 mM苯甲基磺酰氟， 1 mM原钒酸钠, 10 μg/mL 抑肽酶, 50 μg/mL 亮抑肽酶, 和1 μg/mL 胃酶抑素A)裂解细胞。切下的肿瘤样品混匀在裂解缓冲液中，缓冲液含有25 mM β-甘油磷酸盐和0.5% (v/v) 磷酸酶抑制剂混合物，储存在4°C。17860g4°C离心20分钟除去细胞碎片。 在还原条件下将含有5-20 μg蛋白的上清一部分进行SDS-PAGE分析。转至PVDF膜上, 用含有0.05% Tween-20的TBS或5%脱脂奶粉或5% BSA封闭。用以下抗体标记膜: 抗c-Met 多克隆抗体(C-28)和抗VEGFR-2多克隆抗体(C-20); 鼠源抗磷酸酪氨酸克隆4G10以及抗VEGFR-2多克隆抗体,抗磷酸化VEGFR-2 (Tyr996) 多克隆抗体和抗磷酸化c-Met (Tyr1234/1235) 多克隆抗体。利用增强化学发光试剂盒进行检测。利用Image Master-VDS-CL检测系统使免疫反应结果条带可见。利用影响分析仪测量每条条带强度。

细胞实验

• Cell lines:MKN45, EBC-1, Hs746T, SNU-5, A549, SNU-1和MKN74
• Concentrations:5-5000 nM
• Incubation Time:3天
• Method:细胞(1–3 × 103个/100 μL/孔) 接种在96孔板并加入不同浓度的E7050然后培养 3 天。每孔加入10 μL WST-8 试剂 ，利用MTP-500酶标仪测量450 nm处吸光度。 HUVEC (2 × 103个/孔)培养3天，培养基含有HGF (30 ng/mL), VEGF (20 ng/mL)或碱性成纤维生长因子以及连续稀释的E7050。

动物实验

• Animal Models:皮下异种移植模型
• Formulation:无菌蒸馏水配制
• Dosages:50–200 mg/kg
• Administration:口服，一天一次