DCC-2036 (Rebastinib)

DCC-2036是Bcr-Abl抑制剂，作用于Abl1(WT)和Abl1(T315I)，IC50分别为0.8 nM和4 nM,也抑制SRC, LYN, FGR, HCK, KDR, FLT3,和Tie-2,对c-Kit具有低的抑制活性。

靶点

u-ABL1native

p-ABL1native

ABL1H396P

u-ABL1T315I

p-ABL1T315I

IC50

0.8 nM

2 nM

1.4 nM

5 nM

4 nM

体外研究

DCC-2036有效抑制纯化的未磷酸化(u-ABL1native)和磷酸化(p-ABL1native) ABL1,未磷酸化和磷酸化突变型ABL1T315I,及激活环突变ABL1H396P，这种作用为非ATP竞争性的，IC50分别为0.8 nM, 2 nM, 1.4 nM, 5 nM,和4 nM。而且, DCC-2036也抑制SRC家族激酶SRC, LYN, FGR,和HCK,和受体TKs KDR, FLT3,和TIE2，IC50分别为34 nM, 29 nM, 38 nM, 40 nM, 4 nM, 2 nM和6 nM。DCC-2036作用于表达野生型或突变型BCR-ABL1的Ba/F3细胞，具有抗增殖活性，IC50为2 nM到150 nM。此外, DCC-2036也抑制Ph+细胞系K562(IC50 5.5 nM)增殖,且有效诱导表达BCR-ABL1的Ba/F3和K562细胞凋亡。最新研究显示DCC-2036通过显著抑制CML细胞系（与非CML白血病细胞系相比），而选择性抑制BCR-ABL阳性细胞。

体内研究

DCC-2036每天按100 mg/kg剂量口服饲喂给药携带Ba/F3-BCR-ABL1T315I白血病细胞的小鼠移植瘤模型，每天一次，有效抑制BCR-ABL1信号，且显著延长小鼠寿命。

Bafetinib (INNO-406)

MB3957

GNF-2

MB3959

PD173955

1 mg

5 mg

10 mg

1 mM

1.8064 mL

9.0320 mL

18.0639 mL

5 mM

0.3613 mL

1.8064 mL

3.6128 mL

10 mM

0.1806 mL

0.9032 mL

1.8064 mL

50 mM

0.0361 mL

0.1806 mL

0.3613 mL

ABL1激酶亚型实验和抑制效力检测:
通过与丙酮酸激酶/乳酸脱氢酶系统耦合的激酶反应，得到ADP，而测定u-ABL1native活性。 使用分光光度计持续监测NADH 氧化。终反应混合物 (100 µL, 在384孔板中)制备如下: 在含0.1 % 辛基葡萄糖苷和 1 % DMSO, pH 7.5的90 mM Tris 中制备含 u-ABL1 激酶 (1 nM),ABLtide (EAIYAAPFAKKK, 0.2 mM), MgCl2(9 mM), 丙酮酸激酶 (~ 4 单元), 乳酸脱氢酶 (~ 0.7 单元), 磷酸烯醇式丙酮酸 (1 mM), 和NADH(0.28 mM)的 ABL1 激酶/偶联实验组分混合物。此外,制备含DCC-2036（在DMSO中连续稀释3倍 ）的抑制剂混合物，随后稀释到含MgCl2(18 mM)和 0.2 %辛基葡萄糖苷 的180 mM Tris buffer中, pH 7.5。50 µL 抑制剂混合物与50 µL 上 述ABL1 激酶/耦合实验组分混合物混合，然后在30oC下温育2小时，然后加入2 µL 25 mM ATP (终浓度500 µM)开始反应。30oC下，在Polarstar Optima 或 Synergy2酶标仪上记录反应，每隔2秒钟记录一次，持续记录2.5小时。使用读数软件，在1到2小时计算反应速率（斜率）。通过比较反应速率与DMSO对照组，获得抑制百分数。使用 GraphPad Prism在一系列浓度抑制剂时测定一系列抑制百分数，而计算IC50值。ABL1T315I, p-ABL1native或ABL1H396P 的激酶实验与上述相同，除了使用2.2 nM ABL1T315I, 1 nM p-ABL1native或1.3 nM ABL1H396P。实验格式也与上述相同，除了ABL1 中的TIE2,其使用荧光偏振/Transcreener格式。实验条件也与上述相同，除了使用PolyE4Y(终浓度为1 mg/mL) 作为底物，且预温育1小时。

细胞实验

• Cell lines:Ba/F3细胞和原代Ph+白血病细胞
• Concentrations:0到10 μM
• Incubation Time:72小时
• Method:Ba/F3 细胞或原代Ph+白血病细胞按一式三份接种在含实验混合物的96孔板上。72小时后,通过Resazurin或 MTT 试验测量存活细胞。细胞在培养基中稀释，然后加到96孔组织培养板上。细胞温育过夜，然后维持在37oC 下含 5% CO2的湿润环境下。第二天处理细胞。使用DCC-2036处理期间使用无血清培养基。使用MTT 测评细胞存活力。20 mL 储存 MTT 溶液等样加到含200 mL 培养基 (10%终溶液) 的每孔中，然后与细胞温育2小时。温育后，移除培养基，加入200 mL DMSO，溶解甲臜晶体。在550和690 nm处读取吸光值。对双波长(D550 到 D690)进行分析，提高测量的准确性。

动物实验

• Animal Models:BCR-ABL1native或 BCR-ABL1T315I逆转录病毒静脉注射到同系 Balb/c小鼠
• Formulation:DCC-2036溶于0.5% CMC/1% Tween-80
• Dosages:≤100 mg/kg
• Administration:口服处理