R406 (free base)

R406 (free base)是有效的Syk抑制剂，IC50为41 nM,强抑制Syk而不是Lyn,对Flt3作用效果低5倍。

靶点

脾脏酪氨酸激酶(Syk) (Cell-free assay)

IC50

41 nM

体外研究

R406是ATP竞争性Syk抑制剂，Ki为30 nM。在不同细胞中R406选择性抑制Syk依赖的信号通路，EC50为33 nM到171 nM,比作用于Syk非依赖性通路效果高很多。R406作用于多种弥漫性巨大细胞淋巴瘤，抑制细胞增殖，EC50为0.8 μM到8.1 μM。1 μM或4 μM R406处理DLBCL细胞系，诱导caspases 9和3激活,而不激活caspase 8，导致大部分细胞凋亡。用R406预处理B细胞受体(BCR)交联的对R406敏感的DLBCLs，完全抑制SYK525/526磷酸化和BLNK依赖SYK的磷酸化。R406有效降低MMP-9 mRNA水平，处理24和48小时，比对照组分别降低2.8和4.3倍,并降低RL细胞侵袭能力。

体内研究

R406有效作用于多种免疫系统紊乱的动物模型。R406口服给药患免疫复合物导致炎症反应的小鼠，显著抑制皮肤反向被动Arthus反应，按1 mg/kg和5 mg/kg剂量处理,与对照组相比则抑制分别为72%和86%。R406按10 mg/kg剂量处理用胶原抗体处理的鼠，显著降低炎症和肿胀,使渐进性关节炎降低到较低水平，且延迟发病，且作用于K/BxN血清转移小鼠模型，降低临床关节炎达50%。

R406

MB3963

R788 (Fostamatinib) Disodium

MB3964

Fostamatinib (R788)

1 mg

5 mg

10 mg

1 mM

2.1256 mL

10.6281 mL

21.2562 mL

5 mM

0.4251 mL

2.1256 mL

4.2512 mL

10 mM

0.2126 mL

1.0628 mL

2.1256 mL

50 mM

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–

体外荧光偏振激酶实验:
R406在DMSO中连续稀释，然后在激酶buffer(20 mM HEPES, pH 7.4, 5 mM MgCl2, 2 mM MnCl2, 1 mM DTT, 0.1 mg/mL 乙酰化BGG)中稀释到DMSO浓度为1%。室温下加入溶于激酶buffer的ATP和底物, 终DMSO浓度为0.2%。在含 5 μM HS1肽底物 和4 μM ATP的混合物中进行激酶反应，终体积为20 μL，在激酶buffer中加入0.125 ng Syk 开始反应。反应在室温下进行40分钟。加入20 μL 含EDTA/磷酸抗体(1X)/荧光蛋白磷酸肽示踪(0.5X)（在FP稀释buffer中稀释）的PTK猝灭混合物终止反应。然后实验板在室温下黑暗温育30分钟，然后在Polarion荧光偏振读数板上进行读数。R406按11种浓度进行平行实验，使用Prism GraphPad 软件通过回归曲线分析进行曲线拟合而测定IC50值。

细胞实验

• Cell lines:DHL4, DHL6, DHL8, DHL10, Wsu-NHL, Karpas422 (K422), OCI LY1, LY3, LY4, LY7, LY10, LY18, LY19, Pfeiffer, 和 Toledo
• Concentrations:溶于DMSO，浓度为10 mM,终浓度为5 μM
• Incubation Time:72或96小时
• Method:

用连续稀释的R406 (0.3, 0.6, 1.25, 2.5, 或5 μM) 处理DLBCL 细胞系72 或 96小时。通过MTT实验测定细胞增殖，使用annexin V–FITC/碘化丙啶(PI)染色测定细胞凋亡。为了测定caspase9，8和3，细胞裂解，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）进行大小分离，然后进行免疫印迹。

动物实验

• Animal Models:静脉注射 1% 卵清蛋白(OVA)的雌性C57BL/6 小鼠，卵清蛋白 (OVA)溶于含1% Evans 蓝染料的盐水(10 mg/kg)中;携带抗胶原抗体诱导型关节炎的雌性Balb/c小鼠；腹腔注射成年K/BxN鼠血清而诱发关节炎的雌性 C57BL/6小鼠
• Formulation:溶于DMSO，然后在含 35% TPGS, 60% PEG 400, 和5% 丙二醇的盐水中稀释
• Dosages:~10 mg/kg/day
• Administration:口服处理