GSK1070916

GSK1070916是一种可逆的，ATP竞争性的Aurora B/C抑制剂，IC50为3.5 nM/6.5 nM，比作用于紧密相关的Aurora A-TPX2复合体选择性高100倍以上。

靶点

体外研究

GSK1070916选择性抑制Aurora B和Aurora C，Ki为0.38 nM和1.5 nM，而作用于Aurora A 的Ki为490 nM。Aurora B和Aurora C的抑制是时间依赖性的，酶抑制解离半衰期分别为>480 min和270 min。此外，GSK1070916也是ATP竞争性抑制剂。GSK1070916处理人肿瘤细胞，剂量依赖性抑制Aurora B特异性底物，丝氨酸10上组蛋白H3的磷酸化。此外，GSK1070916抑制肿瘤细胞的增殖，在超过100种广泛肿瘤类型的细胞系中，EC50 <10 nM，中值EC50为8 nM。虽然GSK1070916对增殖细胞具有有效活性，但是效能在原代，不分裂的，正常人血管内皮细胞中显著变化。此外，GSK1070916-处理的细胞不会停滞在有丝分裂期，而使其不能分裂，变为多倍体，最终导致细胞凋亡。在另一项研究中，据报道，高水平染色体数与抗Aurora B与C的抑制相关，表明具有绕开高倍性检查点机制的细胞对GSK1070916耐药。

体内研究

GSK1070916(25，50，或100 mg/kg)在小鼠体内剂量依赖性抑制Aurora B特定底物的磷酸化作用，与其广泛的细胞活性相一致，在10种人肿瘤异种移植模型中，包括乳腺，结肠，和两种白血病模型中具有抗肿瘤作用。

1 mg

5 mg

10 mg

1 mM

1.9699 mL

9.8497 mL

19.6994 mL

5 mM

0.3940 mL

1.9699 mL

3.9399 mL

10 mM

0.1970 mL

0.9850 mL

1.9699 mL

50 mM

0.0394 mL

0.1970 mL

0.3940 mL

激酶试验:
GSK1070916抑制Aurora酶的能力使用体内激酶试验测量。该试验测量Aurora A，Aurora B 和Aurora C使合成肽底物磷酸化的能力。对于所有3种Aurora激酶，生物素-Ahx-RARRRLSFFFFAKKK-NH2用于Aurora A–TPX2 LEADseekerTM试验，5FAM-PKAtide用于IMAPTM试验。考虑到Aurora酶的时间依赖性抑制，加入底物起始反应前，Aurora A–TPX2，Aurora B–INCENP和Aurora C–INCENP与不同浓度的GSK1070916培养30分钟。对于Aurora A LEADseekerTM试验，终试验浓度为0.5 nM Aurora A–TPX2，1 μM多肽底物，6 mM MgCl2，1.5 μM ATP，含0.003 μCi/μL [γ-33P] ATP的50 mM Hepes，pH 7.2，0.15 mg/mL BSA，0.01% Tween-20，5 mM DTT 和 25 mM KCl。反应在室温(25 °C)下培育120分钟，加入含有LEADseekerTM磁珠和EDTA的PBS(终浓度为2 mg/mL磁珠和25 mM EDTA)终止。然后将板密封，将磁珠静置过夜。形成的产物使用Viewlux 成像仪定量。对于IMAPTM试验，将Aurora A–TPX2 (终浓度1 nM)，Aurora B–INCENP (终浓度2 nM) 或Aurora C–INCENP (终浓度2.5 nM)加入平板中包含0.15 mg/mL BSA，0.01% Tween 20 和 25 mM NaCl 的5 μL缓冲液(对于Aurora A，25 mM Hepes，pH 7.2，对于Aurora B，25 mM Hepes，pH 7.5，对于Aurora C，20 mM Hepes，pH 7.2)中。混合物在室温下培育30分钟。为起始反应，5 μL底物溶液加入包含相同Hepes的缓冲液，25 mM NaCl，MgCl2(Aurora A, B 和C分别为2, 4 和4 mM)，DTT (Aurora A, B 和C分别为4, 4 和2 mM)，ATP (Aurora A, B 和C分别为4, 4和10 μM)，200 nM 5FAM-PKAtide，0.01% Tween 20和0.15 mg/mL BSA，用于预培养。对于Aurora A 和B，反应在室温下培育120分钟，Aurora C培育60分钟。然后这些反应通过加入10 μL 1:500 (1:600对于Aurora C)渐进结合试剂，即95%渐进结合缓冲液 A 和5%渐进结合缓冲液B终止反应。板在室温下培育大约90–120分钟(允许达到平衡的时间)。板在Molecular Devices Analyst酶标仪上通过荧光偏振模式读取数据。

细胞实验

Cell lines:SW48，Colo 201，SW480，WiDr，Colo205，RKO E6，RKO，LoVo，HCT-116，SW620，HT29，W1417，DLD-1，HCT-8，Colo 320HSR，Hep-3B，OVCAR-3，MEC-1细胞

• Concentrations:0-15 mM
• Incubation Time:6-7 天
• Method:将细胞接种在96孔板推荐的生长培养基中，在37 °C ，5% CO2中培养过夜。第二天，细胞用一系列稀释的GSK1070916处理。此时，一组细胞用CellTiter-Glo处理一段时间，相当于时间为0(T = 0)时测量。用化合物培养6到7天后，细胞增殖使用CellTiter-Glo试剂根据制造商建议的方案测量。Aurora B的抑制诱导核内有丝分裂，作用程度根据细胞类型有所不同，延伸化合物处理时间以精确反映对一大组细胞系的细胞活性的作用。对于细胞活性的分析，减去没有细胞的孔中得到的值，进行背景校正，数据使用Microsoft Excel XLfit4软件以DMSO-处理的对照组样品的百分比绘图。EC50值代表50%最大作用时GSK1070916的浓度。

动物实验

Animal Models:小鼠肿瘤异种移植模型(A549，SW620，HCT116，H460，MCF-7，HL60，K562，Colo205)

• Formulation:2% 聚氧乙烯蓖麻油，2% N,N-二甲基乙酰胺，和 96% 酸化水(pH 5.0)
• Dosages:25，50，或 100 mg/kg
• Administration:静脉注射给药，每天一次