PF-477736

PF 477736是有效的，选择性，ATP竞争性Chk1抑制剂，Ki为0.49 nM，也抑制VEGFR2, Aurora-A, FGFR3, Flt3, Fms (CSF1R), Ret和Yes。作用于Chk1比作用于Chk2选择性高100倍左右。

靶点

ChK1

ChK2

VEGFR2

Yes

Fms

IC50

0.49 nM

47 nM

8 nM

14 nM

10 nM

体外研究

PF 477736(128 nM)作用于CA46 和 HeLa细胞，废除Camptothecin诱导的DNA损伤检查点，这种作用具有剂量依赖性。PF 477736作用于HT29细胞，有效废除Gemcitabine诱导的S期停滞，使凋亡细胞群相应增加。PF 477736(540 nM)作用于HT29细胞，增强Gemcitabine诱导的细胞毒性,这种作用具有时间和剂量依赖性。在MTT法检测中，PF 477736增强一组化疗剂作用于广谱p53缺失的人类癌细胞系的抑制生长活性。PF 477736(360 nM)作用于Gemcitabine停滞的细胞，诱导H2AX磷酸化强度剧增，DNA损伤位点附近产生大量的γ-H2AX分子。PF 477736(0.5 nM)作用于HL-60细胞，在Curcumin存在时，选择性抑制p73和p53磷酸化。PF 477736(360 nM)作用于COLO205细胞，抑制Docetaxel诱导的组蛋白 H3 (Ser10) 和 Cdc25C (Ser216)磷酸化，且增强凋亡。PF 477736(250 nM)与MK-1775联用作用于OVCAR-5细胞，具有显著的协同细胞毒性。PF 477736(250 nM)与MK-1775 联用作用于OVCAR-5细胞，导致DNA含量介于2N和4N之间的细胞累积。PF 477736(250 nM)与MK-1775联用作用于OVCAR-5细胞，DNA复制结束前产生过早的有丝分裂，受损的DNA导致细胞凋亡。

体内研究

PF 477736按4 mg/kg剂量处理大鼠，终末半衰期(T1/2)为2.9小时, AUC为5.72 μg×hr/mL，CLp为11.8 mL/min/kg。PF 477736按Gemcitabine的最大耐受剂量处理携带Colo205移植瘤的小鼠模型，增强抗肿瘤活性，这种作用具有剂量依赖性。PF 477736(12 mg/kg)处理携带Colo205移植瘤的小鼠模型，诱导组蛋白 H3 (Ser10)磷酸化和磷酸化组蛋白 H2AX增加。PF 477736(15 mg/kg)腹腔注射处理COLO205和MDA-MB-231，移植瘤模型，增强Docetaxel诱导的肿瘤生长抑制和肿瘤生长延迟。PF 477736 (10 mg/kg ，腹腔注射，每天一次) 与MK-1775 (30 mg/kg，口服处理，每天两次) 联用作用于携带OVCAR-5移植瘤的小鼠，增强抑制肿瘤生长的效果。

1 mg

5 mg

10 mg

1 mM

2.3839 mL

11.9195 mL

23.8390 mL

5 mM

0.4768 mL

2.3839 mL

4.7678 mL

10 mM

0.2384 mL

1.1920 mL

2.3839 mL

50 mM

–

–

–

结合实验:
在96孔板中30°C下进行实验20分钟，孔中为0.1 mL实验缓冲液，包含50 mM TRIS pH 7.5, 0.4 M NaCl, 4 mM PEP, 0.15 mM NADH, 28 单位乳酸脱氢酶/mL, 16 单位丙酮酸激酶/mL, 3 mM DTT, 0.125 mM Syntide-2, 0.15 mM ATP和25 mM MgCl2。加入1 nM CHK1激酶域开始实验。PF 477736存在时，通过测量初始速率，而测定对CHK1的抑制活性。通过酶动力学和Excel软件分析数据，拟合竞争性抑制的动力学模型，获得Ki值。测评PF 477736的激酶选择性。

细胞实验

• Cell lines:HT29, Colo205, PC-3, MDA-MB-231 和 K562 细胞
• Concentrations:~1 μM
• Incubation Time:96 小时
• Method:

IC50 实验，测量PF 477736作用于p53缺陷的人类癌细胞系的抗增殖效果。每种细胞系接种在96孔实验板中，孔中含完全培养基，细胞呈指数生长，进行贴壁生长16小时。每个实验板添加连续稀释的PF 477736和合适的对照组。细胞与药物温育96小时。温育后，每孔加入在完全培养基稀释的MTT工作储存液，细胞温育4小时。离心后，去除上清液，每孔加入DMSO加入，在SpectraMax酶标仪上在540nm处进行读数。

动物实验

• Animal Models:携带Colo205移植瘤的小鼠模型
• Formulation:50 nM醋酸钠缓冲液和4% 葡萄糖 (pH 4)
• Dosages:40 mg/kg
• Administration:静脉注射