RKI-1447

RKI-1447是一种有效的ROCK1和ROCK2抑制剂，IC50分别为14.5 nM和6.2 nM，有抗侵入和抗肿瘤活性。

靶点

体外研究

RKI – 1447是一种细胞渗透性pyridylthiazolyl -尿素，作为一种有效的，ATP位点靶向Rho激酶抑制剂，并显示针对PKA ， PKN1/PRK1 ， p70S6K/RPS6kB1 ， AKT1 ， MRCKa/CDC42BPA的多效价降低（在1 μM时抑制率分别为 85.5％，80.5％，61.9％ ， 56.0％ ，和50.4％）或其它15种激酶。该RKI-1447/ROCK1复合物的晶体结构表明RKI – 1447是I型激酶抑制剂，通过与铰链区和DFG基序和ATP结合位点结合。在人类癌细胞中，RKI – 1447抑制ROCK底物MLC- 2和MYPT -1的磷酸化，而在浓度高达10μM时对AKT ，MEK，和S6激酶的磷酸化水平没有影响。 RKI – 1447也抑制LPA刺激下ROCK-介导的细胞骨架重组（肌动蛋白应力纤维形成），但不影响PDGF和血管舒缓激肽刺激下PAK-介导的伪足和丝状伪足形成。 RKI -1447抑制乳腺癌细胞的迁移，侵袭和锚定非依赖性肿瘤的生长。

体内研究

在转基因小鼠模型中，RKI-1447有效抑制乳腺肿瘤的生长。小鼠肿瘤用RKI-1447处理时，肿瘤体积增加的平均百分比仅为8.8％。因此，RKI-1447抑制乳腺肿瘤的生长87％，并且和对照小鼠相比，乳腺肿瘤小7.7倍。RKI-1447治疗不会导致小鼠体重减轻。

Thiazovivin

MB4010

Y-27632 2HCl

MB4012

GSK429286A

1 mg

5 mg

10 mg

1 mM

3.0640 mL

15.3200 mL

30.6401 mL

5 mM

0.6128 mL

3.0640 mL

6.1280 mL

10 mM

0.3064 mL

1.5320 mL

3.0640 mL

50 mM

0.0613 mL

0.3064 mL

0.6128 mL

Z-Lyte FRET激酶检测:
激酶的抑制是使用Invitrogen公司的Z-莱特® FRET激酶试验测定的，丝氨酸/苏氨酸13肽底物是基于肌球蛋白轻链序列KKRPQRRYSNVF的。化合物进行8点稀释并做复孔，并进行三次独立实验以确定平均IC50值。测定条件进行了优化，15微升激酶反应体系中含5纳克酶在50 mM HEPES（pH 7.5），10毫摩尔氯化镁，1mM EGTA和0.01％ Brij -35。将反应物温育在室温下1小时，1.5 μM多肽底物和12.5 μM的ATP（为ROCK1）或2μM底物和50 μM的ATP（为ROCK2）。然后将反应停止，并且磷酸化多肽对非磷酸化多肽的比例由非磷酸化肽的选择性裂解来确定。随后香豆素在400 nm发射导致在445 nm激发，且能量转移到荧光素并最后发射在520 nm。该底物包含香豆素和荧光素，只有未切割磷酸化底物将发生FRET。445 nm和520 nm处的信号比是使用Wallac的EnVision读板仪（型号为2102平板读数器）测量的。

细胞实验

• Cell lines:MDA-MB-231
• Concentrations:~600 μM
• Incubation Time:72 小时
• Method:细胞接种在96孔组织培养板（每孔1200个细胞），并孵育24小时。孵育后，细胞用空白或不同浓度梯度的RKI-1447处理72小时。温育后，新制备的MTT（2 mg/ml）加入到每孔中，并温育3小时。孵育后在540 nm处读板。

动物实验

• Animal Models:MMTVneu 转基因小鼠 [FVB/N-Tg (MMTVneu) 202 Mul/J]
• Formulation:20％ 2-羟丙基-β-环糊精（HPCD）
• Dosages:200 毫克/千克/天
• Administration:腹腔注射