AR-A014418

AR-A014418是一种ATP竞争性和选择性的GSK3β抑制剂，无细胞试验中IC50和Ki为104 nM和38 nM，而对被测试的其他26种激酶没有显著抑制作用。

特性

细胞渗透性GSK3选择性抑制剂。

靶点

体外研究

在3T3成纤维细胞中，AR-A014418抑制GSK3特定位点(丝氨酸396)τ蛋白磷酸化，其IC50 是2.7 μM，进而保护N2A细胞免遭抑制 PI3K/PKB信号通路引起的死亡。在海马切片中，AR-A014418抑制由β样淀粉肽诱导的神经退化。在NGP细胞和SH-5Y-SY细胞中，AR-A014418抑制神经内分泌标志物，抑制神经瘤细胞的生长。

体内研究

在SOD1蛋白G93A突变肌萎缩性脊髓侧索硬化症的小鼠模型中，腹腔注射AR-A014418 (0-4 mg/kg, i.p.)能够延长症状的发生，增加肌肉活力，减慢疾病发生。此外，AR-A014418通过调节脊髓中的NMDA和代谢型受体信号通路和TNF-α 和 IL-1β的释放来发挥对小鼠乙酸和甲醛诱导的伤害感受的抑制作用。

AZD1080

MB4519

BIO-acetoxime

MB3793

GSK343

1 mg

5 mg

10 mg

1 mM

3.2435 mL

16.2174 mL

32.4349 mL

5 mM

0.6487 mL

3.2435 mL

6.4870 mL

10 mM

0.3243 mL

1.6217 mL

3.2435 mL

50 mM

0.0649 mL

0.3243 mL

0.6487 mL

GSK3闪烁迫近分析法:
竞争性实验是在干净底部的孔板中用10个不同的浓度梯度重复两次来测定的。 生物素标记的多肽biotin-AAEELDSRAGS(PO3H2)PQL以2μM的浓度加入到含有6单位的重组人GSK3（α 和β等量混合）12 mM MOPS，pH 7.0, 0.3 mM EDTA，0.01% β-mercaptoethanol，0.004% Brij 35，0.5% glycerol，和0.5 μg 牛血清蛋白/25 μl中孵育10-15分钟。在50mM Mg(Ac)2中加入0.04 μCi of [γ-33P]ATP和未标记的ATP，ATP的终浓度是1 μM，反应体积是25ul，使反应开始进行。使用不加多肽底物作为空白对照。 室温孵育20分钟以后，用含有5 mM EDTA，50 μM ATP，0.1% Triton X-100，以及 0.25 mg链霉亲和素包被具有35 pmol的结合能力的珠子来终止反应。6小时以后，用液体闪烁计数器测定放射性。用GraphPad Prism通过非线性回归来分析抑制曲线。

细胞实验

• Cell lines:N2A 细胞
• Concentrations:~50 μM
• Incubation Time:24小时
• Method:

细胞活性通过钙黄绿素和碘化吡啶摄入来测定。活细胞具有酯酶，能够将钙黄绿素摄入和排出，产生黄绿荧光。碘化吡啶只能被死细胞摄入，产生橘红色荧光。 简单的说，N2A细胞在体外培养2天，然后在AR-A014418或者载体(DMSO) 存在下用50 μM LY-294002处理24小时。然后，N2A细胞在2 μM PI 和1 μM钙黄绿素-AM存在下孵育30分钟。随后培养基用包含2 mM CaCl2的Hanks’缓冲盐溶液洗3次，细胞通过Zeiss Axiovert 135荧光显微镜进行观察。分析3个区域（随机挑选）至少3个不同实验中每孔的情况（大约300个细胞每个区域）。以PI染色阳性的细胞比上总的细胞的比值作为细胞死亡的百分比。在每次试验中，每次都是扣除空白对照中死亡的细胞数之后计算的。

动物实验

• Animal Models:携带 G93A突变体人类SOD1的ALS小鼠模型。
• Formulation:生理盐水
• Dosages:~4毫克/千克
• Administration:腹腔注射