丹诺普韦

丹诺普韦是肽类抑制剂，作用于丙型肝炎病毒(HCV)的NS3/4A protease，IC50为0.2-3.5 nM,抑制HCV基因型1A/1B/4/5/6比抑制2B/3A效果高10倍左右。

靶点

HCV NS3/4A蛋白酶

IC50

0.2-3.5 nM

体外研究

0.29 nM Danoprevir抑制NS3/4A蛋白酶,而10 μM Danoprevir却不能抑制一组79种蛋白酶，离子通道，转运蛋白，及细胞表面受体。Danoprevir与NS3/4A第一次结合能维持5小时以上，且保持抑制作用状态。Danoprevir (45 nM)消除病人肝细胞衍生的Huh7细胞衍生的HCV基因型1b复制子，EC50为1.8 nM。含个体突变的HCV亚基因组复制子细胞系, V36M, R109K,和V170A替换不会抗Danoprevir,但是R155K替换则高度抗Danoprevir。Danoprevir作用于转染重组病毒的Huh7.5细胞,显示出抗病原体抑制效果，作用于HCV基因型1, 4,和6时，IC50为2-3 nM,比作用于基因型2/3/5 (280-750 nM)低100倍以上。

体内研究

Danoprevir按30 mg/kg剂量处理鼠或猴12小时，使肝脏浓度下降，然后提高Danoprevir浓度，从细胞中消除复制子。

特征

Danoprevir丙型肝炎病毒(HCV)的NS3/4A蛋白酶的模拟抑制剂。

Ledipasvir (GS5885)

MB7224

Paritaprevir(ABT-450)

MB4255

Lomibuvir (VX-222, VCH-222)

1 mg

5 mg

10 mg

1 mM

1.3664 mL

6.8322 mL

13.6644 mL

5 mM

0.2733 mL

1.3664 mL

2.7329 mL

10 mM

0.1366 mL

0.6832 mL

1.3664 mL

50 mM

0.0273 mL

0.1366 mL

0.2733 mL

持续荧光反应能量转移(FRET)实验:
实验buffer含25 μM NS4A肽, 50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 15% (vol/vol)甘油, 0.6 mM月桂基二甲基氨基氧化物, 10 mM二硫苏糖醇, 及0.5 μM 荧光素/QXL520标签的FRET底物{Ac-DE-Dap(QXL520)-EE-Abu-ψ-[COO]-AS-Cys(5-FAMsp)-NH2}. 加入50 pM K2040 酶开始反应。反应在96孔板上黑暗中进行，收集荧光数据。对照组没有抑制剂，有酶参与。分析反应的线性相位计算起始反应率，从而获得IC50值。10 nM NS3/4A 和两倍量Danoprevir 在1×实验buffer中预温育15分钟形成Danoprevir-NS3/4A复合体测定活性。随后，快速稀释复合体，稀释200倍，加到含底物的实验buffer中。对照组条件相同，但是NS3/4A和Danoprevir没有预温育，酶加入复合体反应混合物中，开始反应。此外，对照组没有或NS3。反应进行超过5小时。

细胞实验

• Cell lines:携带HCV复制子的Huh7细胞
• Concentrations:5 pM 到100 nM
• Incubation Time:48小时
• Method:进行抗病原体的实验，接种细胞，梯度稀释的Danoprevir加到含K2040复制子的Huh7细胞中。温育48小时后，提取细胞内 RNA,通过RT-PCR，使用引物 (5’-CACTCCCCTGTGAGGAACTACTG-3’ 和5’-AGGCTGCACGACACTCATACT-3’) 和HCV 5非翻译区的特定探针(5’-6-FAM-CTTCACGCAGAAAGCGTCTAGCCATGG-MGBNFQ-3’, FAM为6-羧基荧光素，MGBNFQ为分子槽沟，结合到非荧光猝火器上) ，且使用ABI Prism 7900 序列检测器系统测定HCV复制子RNA水平。使用TaqMan Gold RT-PCR 试剂进行单管反应。RNA 规格和样本的三次重复反应在50 μL含 5 μL细胞内 RNA (50 ng)的buffer中进行。RT在48oC下进行30分钟，随后在95oC下进行10分子。PCR反应流程如下， 95oC下进行15秒， 60oC下进行1分钟，循环40次。测定每个RNA浓度，做三次平行。根据标准曲线测定复制子RNA的绝对浓度。根据复制子水平测定EC50值。

动物实验

• Animal Models:Sprague-Dawley鼠, 食蟹猴
• Formulation:用水稀释，鼠实验使用6 mg/mL，猴实验使用 3 mg/mL
• Dosages:30 mg/kg
• Administration:口服饲喂