AZ 960

AZ 960是一种新型的，ATP竞争性的JAK2抑制剂，IC50和Ki分别低于3 nM和0.45 nM，作用于JAK2比作用于JAK3选择性高3倍。

靶点

体外研究

AZ 960抑制JAK2酶活性，Ki为0.45 nM，IC50<3 nM。此外, 0.1 μM AZ960也抑制 83 种激酶中的31种，如 JAK3(IC50为9 nM), TrkA, Aurora, 和 ARK5。AZ 960作用于TEL-JAK2细胞，抑制STAT5磷酸化，平均IC50为15 nM，作用于 TEL-JAK2驱动的STAT5磷酸化比作用于其他 JAK 激酶家族成员(TEL-JAK1, -JAK3, 和 -TYK2)驱动的细胞系选择性高15到30倍。AZ 960 有效抑制 TEL-JAK2, -JAK1, -JAK3, 和-Tyk2细胞增殖，GI50 分别为 25 nM, 230 nM, 279 nM, 和214 nM。而且, 通过降低 STAT3 和 STAT5磷酸化水平，AZ 960 也有效抑制SET-2 细胞增殖，平均 GI50为 33 nM。AZ 960 引起人类 T-细胞淋巴嗜淋巴细胞病毒1型（HTLV-1）感染的 T细胞 (MT-1 和 MT-2)生长停滞和凋亡,且通过小干扰 RNA 增强AZ 960 作用于 MT-1细胞的抗增殖效果，而抑制 Bcl-xL。最新研究显示 AZ 960显著抑制患者新分离的AML细胞克隆性生长，和诱导细胞凋亡。

AT9283

MB3924

AZD1480

MB3926

Baricitinib (LY3009104, INCB028050)

1 mg

5 mg

10 mg

1 mM

2.8220 mL

14.1099 mL

28.2199 mL

5 mM

0.5644 mL

2.8220 mL

5.6440 mL

10 mM

0.2822 mL

1.4110 mL

2.8220 mL

50 mM

0.0564 mL

0.2822 mL

0.5644 mL

酶的生化检测及激酶剖析:
使用重组JAK2 激酶 (第808–1132位氨基酸)在肽(Tyk2 肽)浓度为 100 nM 和ATP 浓度为15 μM时，进行AZ 960抑制研究。使用的AZ 960浓度为 0.003 μM 到30 μM。通过抑制动力学研究进一步评估AZ960作用于JAK2激酶的抑制模式和抑制常数 (Ki)。在含混合浓度肽 (FL-Ahx-IPTSPITTTYFFFKKK-COOH), 及不同浓度 ATP 和 AZ 960的HEPES buffer(75 mM, pH 7.3)中进行一系列JAK2 催化反应。通过 Caliper LC3000 系统监测每组反应进程，然后从相应反应时间过程中抽提初始反应速度。为了定义抑制模式，使用Lineweaver-Burk曲线，绘制初始速度对相应ATP浓度的曲线，则y轴上的收敛特征说明AZ 960对ATP的竞争能力。使用米氏方程，计算Ki，显示AZ960是结合紧密的 JAK2抑制剂。AZ960按三种抑制浓度(0.01 μM, 0.10 μM, 和 1.0 μM)作用于83种激酶。

细胞实验

• Cell lines:SET-2 和TEL-JAK Ba/F3
• Concentrations:0.016 到 10 μM
• Incubation Time:48-72 小时
• Method:使用荧光/比色BIOSOURCE AlamarBlue 检测分析细胞增殖，然后在 Spectra Max Gemini EM 酶标仪上读数。SET-2 细胞按每孔 20,000 个细胞, TEL-JAK2 Ba/F3 细胞按每孔 2000 个细胞,所有其他 TEL-JAKs 按每孔5000个细胞接种在96孔板上。接种后，使用AZ 960处理细胞24小时，然后SET-2细胞生长72小时，TEL-JAK Ba/F3 细胞生长48小时。随后在指定生长期加入Alamar Blue (10 μL/孔)， 细胞在 37oC 下 5% CO2环境下温育2小时, 然后在545 (激发光) 和 600 nm (发射光)处测定荧光值。使用Microsoft Excel的Xlfit4版本4.2.2计算GI50值。