Allitinib tosylate (AST-1306 TsOH)

AST-1306是新型，不可逆的EGFR和ErbB2抑制剂，IC50分别为0.5 nM和3 nM,也有效作用于突变型EGFR T790M/L858R,更有效作用于过表达ErbB2的细胞,作用于ErbB家族比作用于其他激酶选择性高3000倍。

靶点

EGFR

ErbB4

ErbB2

EGFR T790M/L858R

IC50

0.5 nM

0.8 nM

3.0 nM

12 nM

体外研究

AST-1306选择性抑制EGFR和ErbB2酪氨酸激酶活性。AST-1306也有效抑制T790M/L858R双突变型EGFR，IC50为12 nM。AST-1306效果比Lapatinib高500多倍。AST-1306作用于ErbB家族激酶比作用于其他激酶家族包括PDGFR, KDR和c-Met选择性高3000多倍。AST-1306可能与EGFR和ErbB2氨基酸残基共价结合。AST-1306显著抑制HIH3T3-EGFR T790M/L858R细胞生长，存在浓度依赖性。AST-1306作用于HIH3T3-EGFR T790M/L858R细胞，有效抑制EGFR磷酸化。而且, AST-1306抑制含EGFR T790M/L858R突变的NCI-H1975细胞生长，这种作用存在浓度依赖性。AST-1306抑制EGFR及其下游通路的磷酸化。此外, AST-1306作用于A549细胞,显著抑制EGF诱导的EGFR磷酸化，这种作用存在剂量依赖性。AST-1306作用于人癌细胞包括A549细胞, Calu-3细胞和SK-OV-3细胞，抑制EGFR和ErbB2及其下游信号磷酸化。

体内研究

AST-1306每天口服处理SK-OV-3和Calu-3移植瘤模型，显著抑制肿瘤生长。AST-1306处理SK-OV-3模型，7天后，肿瘤几乎完全消失。相反, AST-1306作用于HO-8910和A549移植瘤，只稍微抑制肿瘤生长。因此, AST-1306作用于过量表达ErbB2的肿瘤模型，效果比表达低水平ErbB2的肿瘤效果高很多。AST-1306耐药性很好。Lapatinib作用于过量表达ErbB2的肿瘤模型，具有抗癌活性，但是按相同剂量及饲喂安排作用于SK-OV-3移植瘤模型，AST-1306比Lapatinib效果好。此外, AST-1306口服处理FVB-2/Nneu模型，每天两次，持续3周，显著抑制肿瘤生长。处理11天后,肿瘤几乎完全消失。在药物处理期间，鼠体重降低小于20%。

Tyrphostin 9

MB5251

WZ4002

MB3997

ZM306416

1 mg

5 mg

10 mg

1 mM

1.6101 mL

8.0505 mL

16.1010 mL

5 mM

0.3220 mL

1.6101 mL

3.2202 mL

10 mM

0.1610 mL

0.8050 mL

1.6101 mL

50 mM

0.0322 mL

0.1610 mL

0.3220 mL

酪氨酸激酶实验:
在20 μg/mL 聚(Glu,Tyr)4:1预包被的96孔ELISA 板上测定酪氨酸激酶活性。首先, 每孔中加入在激酶反应buffer(50 mM HEPES pH 7.4, 20 mM MgCl2, 0.1 mM MnCl2, 0.2 mM Na3VO4, 1 mM DTT) 中稀释的80 μL 5 μM ATP溶液。不同浓度AST-1306 在10 μL 1% DMSO (v/v) 中稀释，然后加到每孔中，对照组使用1% DMSO (v/v)。随后，加入在10 μL 激酶反应缓冲液中稀释的纯化酪氨酸激酶蛋白，开始激酶反应。 每种浓度的实验各进行重复实验。在37oC下温育60分钟后, 使用含0.1% Tween-20 (T-PBS)的PBS冲洗实验板三次。然后,加入在含5 mg/mL BSA的T-PBS中稀释的 100 μL磷酸酪氨酸抗体 (PY99, 按1:500稀释)。 在37oC下温育30分钟后,实验板再和之前一样冲洗三次。加入在含5 mg/mL BSA的 T-PBS中按1:2000稀释的辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG(100 μL)。然后实验板在37oC下预温育30分钟，然后使用 PBS冲洗。最后, 加入100 μL 含0.03 % H2O2和溶于0.1 M柠檬酸缓冲液（pH 5.5）的2 mg/mL o-对苯二胺的溶液，与样本在室温下温育，直到出现颜色。加入50 μL 2 M H2SO4终止反应,使用多孔分光光度计在 490 nm处读数。测定IC50值。

细胞实验

• Cell lines:Calu-3和A-549细胞系
• Concentrations:0.001-1 μM
• Incubation Time:72小时
• Method:使用SRB(Sulforhodamine B)实验测定细胞(包括Calu-3, A-549细胞系等)增殖。细胞接种在96孔板上，培养24小时。使用浓度不断增长的AST-1306处理细胞72小时。维持培养基原样直到实验结束。细胞与10% 预冷的三氯乙酸(TCA)在 4oC下混合1小时，然后在室温下使用 100 μL溶于1%乙酸的 4 mg/mL SRB 溶液染色15分钟。移除SRB，然后使用1% 乙酸快速冲洗细胞5次。晾干细胞, 蛋白结合染料在 150 μL 10 mM Tris 碱中溶解5分钟，然后使用多孔分光光度计在515 nm 测量。测定IC50值。

动物实验

• Animal Models:携带SK-OV-3移植瘤的裸鼠和SK-OV-3FVB-2/Nneu转基因鼠
• Formulation:0.5%羟丙基甲基纤维素(HPMC), 使用玛瑙研钵进行研磨
• Dosages:25 mg/kg, 50 mg/kg和100 mg/kg
• Administration:口服处理,每天两次