产品简介:
“双报告基因”检测系统通常被用来提高实验精确度,即在一个系统中同时表达和测量两个独立的报告基因。一般来说,实验组报告基因与具体实验条件的影响是相关的,而共同转染的内对照组报告基因则是用来充当校正参数,作为内参提供反应基线。将实验组的结果与内对照组的结果进行约化处理,可降低由细胞存活率或转染效率的差异而导致的结果波动,同时还可消除仪器测定引起的实验误差。因此,双报告基因检测可以通过减少外部影响来获得更可靠的实验数据。
美仑Bio-Nano&Firefly双萤光素酶报告基因检测系统是一种辉光型定量检测试剂盒,具有高灵敏度和发光信号稳定的特点,符合高通量检测的需求。该检测试剂盒在同一个样品中先以一种新型萤光素为底物来检测萤火虫萤光素酶(Firefly luciferase),后以新型底物来检测Bio-Nano萤光素酶,同时淬灭Firefly luciferase的萤光信号,实现双萤光素酶报告基因检测。
相比于美仑辉光型Firefly&Renilla-Light双萤光素酶报告基因检测试剂盒(MA0520),本品Bio-Nano&Firefly双萤光素酶报告基因检测试剂盒(PWL209)具有以下优点:
√ 采用了全新的萤光素酶检测新型底物和Bio-Nano萤光素酶,具有更高的发光强度,该辉光型试剂盒近乎达到了闪光型双萤光素酶报告基因检测试剂盒(MA0518)的灵敏度;
√ 具有更好的发光信号的稳定性,近乎2小时(22℃)的信号半衰期为实验设计提供了更大的灵活性;高通量检测无需依赖自动进样器,并且无需弃培养液、离心等步骤,简化了实验流程,满足绝大多数高通量实验需求;
√ 本试剂盒组分做了大量优化,与传统闪光型产品相比,无明显刺激性气味;
√ 可用于多种常用细胞培养液:RPMI 1640、DMEM、MEM-α、F12、DMEM/F12等。
本试剂盒中Bio-Nano萤光素酶使用一种新型底物,可产生高强度、辉光型发光,底物自主开发,国内使用无专利风险。本品遵守严格的生产及质控程序,更加符合生物药研发企业使用。
反应原理如下:
保存条件:
未开封试剂盒-20℃保存,自生产之日起一年有效。
溶解分装后的Dual-Firefly Luciferase Substrate于-70℃避光保存一年,或-20℃短期保存不超过一个月。
运输条件:
干冰运输。
注意事项:
1.检测仪器选择:能够检测化学发光的仪器都适用本试剂盒的检测,但是针对相同的样品,不同检测器本底信号值和测量值均可能不同;且对于同一样本检测,不同仪器的数值不可横向比较。为防止孔间干扰,推荐使用不透明白色或黑色细胞培养板。
2.由于发光信号会受到检测环境如培养基组分、温度等影响,所以应确保同组内不同样本检测条件一致。
3.酶促反应对温度较为敏感,加样检测前务必将检测工作液以及细胞培养板平衡至室温。
4.为取得最佳检测结果,加入Bio-Nano Luciferase检测工作液后,需要孵育至少10min才可以检测Bio-Nano Luciferase报告基因活性,其中包括振动混匀至少3min。
5.Bio-Nano萤光素酶具有超强信号稳定性,半衰期可达2小时。但是当酶表达量过高时,信号半衰期会缩短,建议优化实验设计方案(如减少质粒转染量),避免萤光素酶表达量过高。
6.Stop&Bio-Nano Luciferase Substrate (100x) 配制在无水乙醇中。由于无水乙醇容易挥发,有时会在初次使用时发现体积明显小于包装规格的情况,此时用无水乙醇把体积补足至包装规格,并混匀后即可使用。
数据展示:
1、Firefly萤光素酶和Nano萤光素酶的发光稳定性及线性检测
方法:在体外将同等浓度的Firefly萤光素酶和Nano萤光素酶纯酶分别使用PWL209及P品牌同类产品检测纯酶水平发光情况。
结果:PWL209的发光亮度强于P进口品牌,PWL209稳定性在1h内与P进口品牌差异不大。PWL209线性关系良好。
图1. Firefly萤光素酶发光稳定性及线性检测
图2. Nano萤光素酶发光稳定性及线性检测
2、细胞内Firefly萤光素酶和Nano萤光素酶发光稳定性及线性检测
方法:细胞培养体系下验证光强稳定性及细胞密度-光强标曲。将Firefly萤光素酶和Nano萤光素酶载体瞬时转入HEK293T细胞,24h后分别使用PWL209及P品牌同类产品检测细胞水平发光情况。
结果:PWL209的发光亮度强于P进口品牌,PWL209稳定性在1h内与P进口品牌差异不大。PWL209线性关系良好。
图3. 细胞内Firefly萤光素酶发光稳定性及线性检测
图4. 细胞内Nano萤光素酶发光稳定性及线性检测
3、Bio-Nano&Firefly发光淬灭效果
方法:相同浓度的Firefly、Bio-Nano萤光素酶的体系中,依次加入Firefly Luciferase 检测工作液和Bio-Nano Luciferase 检测工作液,分别记录两者萤光素酶的发光强度以及淬灭情况。
结果:由图可知,美仑组的双酶发光强度与P进口品牌基本无差别,并且淬灭效率要高于P进口品牌。
图5. Bio-Nano&Firefly发光淬灭效果
4、细胞内对报告基因应答的影响
方法:将含有NF-κB应答元件的启动子调控下的编码Bio-Nano萤光素酶质粒和Firefly萤光素酶内参质粒瞬时转染至HEK293T细胞中。转染后24h,进行TNF-α浓度梯度诱导(6h)。在细胞培养体系内,按照说明书步骤依次孵育并使用酶标仪分别检测双酶的信号读值,并对Bio-Nano和Firefly光强进行约化处理(Bio-Nano/Firefly)。
结果:由图可以明显看出Bio-Nano/Firefly比值与给药浓度呈正相关,并且PWL209的检测效果优于P品牌。
图6. TNF-α梯度诱导NF-κB信号通路检测效果
5、在哺乳动物细胞多种培养基中检测Bio-Nano /Firefly萤光素酶的相对发光信号
方法:将Bio-Nano /Firefly萤光素酶稀释在多种培养基中,与Firefly Luciferase检测工作液和Bio-Nano Luciferase检测工作液1:1混合后,检测发光信号。用MEM-α培养基进行数据归一化。
结果:PWL209萤光素酶报告基因检测系统与多种细胞培养基相兼容。
图7. PWL209报告基因检测系统在多种培养基中的检测情况
6、Bio-Nano /Firefly酚红耐受能力检测
方法:配制含有酚红浓度梯度的DMEM溶液0-20mg/L,每组分别加入等量的Bio-Nano萤光素酶或Firefly萤火虫萤光素酶,再检测Bio-Nano、Firefly的发光效果。
结果:PWL209萤光素酶报告基因检测系统具有较好的酚红耐受力。
图8. PWL209报告基因检测系统酚红耐受检测情况
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